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突变检测系统操作规程

突变检测系统操作规程

 

一、封槽

1. 95 %乙醇清洗擦净大小两块玻璃板及间隔条,干燥。

2.将间隔条置于大块玻璃板两侧边缘,外边缘与玻璃板边缘相齐。

3.将小块玻璃板置间隔条上,对齐,并用夹子固定。

二、胶的制备

用不同体积的两种变性剂和丙烯酰胺贮存液配置变性剂要求浓度的胶。经验

上讲,胶的体积以刚好覆盖胶板为宜。

1.清洗梯度合成器并使之干燥,并关掉两个槽之间的活栓。

2.干燥梯度合成器的槽。

3.分别向两个浓度的变性剂溶液中加4.5 µ L / mL 10% APS1µ L / mLTEMED,搅拌均匀。

4.把高浓度变性剂溶液加到梯度合成器右边的槽中,低浓度变性剂溶液加到梯度合成器左边槽中。

5.将连接梯度合成器的出口针头置于胶板之间并固定。

6.推动梯度形成器形成的梯度分离胶即注入两层玻璃板之间。在混合和灌胶时应避免产生气泡。

7.分离胶灌完后,取出针头,将其置于一个锥形瓶中,并停止搅拌。

8.冲洗梯度合成器的两个槽,打开泵,排出其中水分。

9.在浓缩胶中加入10% APSTEMED并将浓缩胶灌入两层的玻璃板之间。

10.待浓缩胶充满后,在其顶部插入梳子(避免产生气泡),放置1 h

三、电泳

1.在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液,打开电泳仪预热到60 ℃。

2.取掉梳子,用蒸馏水清洗没有凝聚的胶,并将胶板固定在电泳槽内。

3.调节缓冲液的高度,使其刚刚超过胶上的加样孔。

4.用缓冲液清洗加样孔(注射器及针头)。

5.向胶顶部的加样孔中加入PCR的产物。

6.盖上电泳仪的盖子,打开开关,电泳220 v10 min,随后85 v 16 h